Nthowa Yakupimira Mitundu Na Kupima Mitundu Na ELISA

(1) kuŵika mitundu

Chromogenic ELISA ndiyo nthowa yaumaliro ya kuŵika mtundu, pa nyengo iyi enzyme yikupangiska kuti chinthu chambura mtundu chiŵe na vinthu vya mitundumitundu. Kutentha kwa vyakuchitika na nyengo vichali vinthu ivyo vikukhwaska kukura kwa mtundu. Mu nyengo yinyake, mbuna yiheni yingakhala yambura mtundu, ndipo mbuna yiwemi na kutambasuka kwa nyengo na kukhozga mtundu. Kuwonjezera kutentha kwakwenelera kukuwovwira kuti mtundu ukule mwaluŵiro. Mu kusankha unandi, kutentha kwakuchitika na nyengo pamanyuma pa kusazgirako chinthu chapasi vikwenera kuŵa vyakwenelera mwakuyana na malango. Qualitatively kukhazikiska mtundu ungachitika pa chipinda kutentha, nyengo kanandi yikukhumbikwira yayi kulaŵilirika mwakukhora, nyengo zinyake mwakuyana na kulaŵilira kwakukhozga makora na kulaŵilira kwakukhozga makora mtundu wa mtundu ungaŵa wakukwana kufupikiska panji kutambasura nyengo yakuchitirapo kanthu, kweruzga kwa nyengo yake.

Kukula kwa mtundu wa OPD substrate kanandi kukuya chomene yayi pamanyuma pa mphindi 20-30 zakuchitira pa kutentha kwakunja panji 37℃, ndipo nyengo yakuchitira vinthu yingasazgikira kuti yiwonjezge mtengo wa m’manyuma. Maji gha OPD substrate ghazamusintha mtundu mwaŵene para ghali pa ungweru. Kuchita kwa mtundu kuyenera kuchitika mu mdima. Para mtundu wa mtundu wamara, ŵakusazgapo yankho lakumalizga kuti ŵamalizge mtundu. Pamanyuma pakuti chinthu cha OPD chamara na sulfuric acid, mtundu ukusintha kufuma ku chikasu cha olenji ku chikasu cha bulawuni.

TMB yikukhwaskika yayi na ungweru ndipo yingaŵikika pa thebulu la opareshoni pa kutentha kwa chipinda kuti yiwone ivyo vikufumamo na vyakuchitika vya pambali. Kweni kuti ivyo vyasangika pa kuyezga viŵe vyakukhora, ntchiwemi kuŵazga ivyo vyasangika pa nyengo yakwenelera. Pamanyuma pa wovwiri wa HRP, mtundu wa TMB ukafika pafupifupi mphindi 40, ndipo pachokopachoko ukachepa nkhongono, ndipo ukazgeŵa chomene na kuŵa wambura mtundu pamanyuma pa maora ghaŵiri. TMB wakumalizga mu mayankho ghakupambanapambana. Vinthu ivyo vikukanizga enzyme nga ni sodium azide na sodium dodecyl sulfate (SDS) vingapangiska kuti thupi lileke kucita vinthu vinyake. Mtundu uwu wa terminator ungapangiskaso kuti mtundu wa buluu uŵepo kwa nyengo yitali (maora 12-24), ni terminator yiwemi ya kweruzga kwakuwoneka. Kusazgirapo apa, vigaŵa vyakupambanapambana vya asidi vizamusintha buluu kuŵa chikasu, apo utali wa mafunde wakumanyikwa (450nm) ungagwiliskirika nchito kuti uŵerenge mtengo wa kuyamwa.

(2) kupima mitundu

Pambere ŵandapimire mtundu, ŵakwenera kugwiliskira nchito pepala lakutowa lakupokera maji kuti ŵawume maji agho ghali kuŵikika pasi pa mbale, ndipo pamanyuma mbale yikwenera kuŵikika makora mu furemu ya mtundu wa enzyme standard colorimeter. Mu mayeso na mbale yakufewa nga ni wakunyamura, mbale yikwenera kuŵikika mu furemu ya 96-hole pambere kuyezgelera kwa mitundu kungachitika. Pambere mundasazgireko mtundu wa mtundu, dumurani mphepete mwa mbale yakufewa mwakutowa, mwakuti mbale yikhale mwakukwana mu furemu ya mpando.

Para colorimetry, zero point yikwenera kusinthika na maji ghakupangika dankha, ndipo mbuna ya substrate (mbuna iyo yili na yankho la substrate ilo likusazgikira kwambura kuchitapo kanthu) na mbuna yambura kanthu (mbule iyo yili na mchere panji diluent m'malo mwa chiyelezgero nga ni ndondomeko yose) yikwenera kupimika na kuŵazgika kuti yilembe umo mayeso ghakuŵira. Kufuma apo mabowo ghambura kanthu ghangagwiliskirika nchito kuti ghapimire zero point na maji ghakupangika na maji ghakuthukira, ndipo kuyamwa kwa mabowo agho ghali pacanya apa kukwenera kufumiskikapo pa kuyamwa kwa mabowo ghambura kanthu, ndipo pamanyuma pake kuŵerengeka.

Kuyowoya kwa chigaŵa cha colorimetric ni oplical density (OD) mu nyengo yakale, kweni kuyamwa (A) kukugwiriskirika nchito mwakuyana na malango, agho ghali na ng’anamuro limoza. Nthowa yakumanyikwa yakuyowoyera njakuti mulembe utali wa mafunde ya kuyamwa mu ngodya ya musika ya chilembo A. Mwachiyelezgero, utali wa mafunde ya OPD ni 492nm, ndipo nthowa yakuyowoyera ni "A492nm" panji "OD492nm".

(3) enzyme yakumanyikwa ya mtundu

Enzyme standard colorimeter yikuchemeka kuti chida cha enzyme, kanandi yikung’anamura photometer yakupimira kuyamwa kwa vyakuchitika vya ELISA. Malinga na mitundu yakupambanapambana ya carrier wakukhora, pali mapangidwe ghapadera gha mbale, mikanda na chubu chichoko cha kuyezgera. Makampani ghanandi ghakupanga vyakuyezga ghakupereka chipangizo chakuyana cha enzyme. Ma index ghakuru ghakugwira ntchito gha chida cha mbale ya enzyme ni: kuŵazga mwaluŵiro, kuŵazga mwakukwana, kuwerezgawerezga, digiri na mtundu wakupimika, mzere na vinyake. Kuŵerenga kwa mita yiwemi ya microplate kanandi kukuŵa 0.001, na kugomezgeka ± 1% na kuwerezgawerezga mpaka 0.5%. Mwachiyelezgero, usange mtengo wa A wa mbuna ya A ni 1.083, mbwenu mtengo waunenesko wa A wa mbuna pakuyaniska na mphepo ukwenera kuŵa 1.083 ± 0.01 (1.073 ~ 1.093). Kuyeza kwakuwerezgawerezga kanandi waka, mtengo wa A ukwenera kuŵa 1.083 ± 0.05 (1.078 ~ 1.088). Mtundu wa kuyeza wa enzyme mbale analyzer ukupambana mwakuyana na kugwira ntchito kwa enzyme mbale analyzer. Mphepete ya chipangizo choyezgelera mbale za enzyme zakumanyikwa ndi 0.000 ~ 2.000, kweni mphaka ya chipangizo chiphya cha enzyme mbale chikukura kufika pa 2.900, panji kujumphirapo. Mtengo uwo ukujumpha mphaka ya pachanya ya kuyezga kanandi ukulongoreka na "*" panji "pa" panji vimanyikwiro vinyake. Tikwenera kuŵika mtima pa mphambano pakati pa mzere uwo ungapimika na mzere uwo uli pa mzere. Mzere wa mzere kanandi ukuŵa uchoko kuluska mzere uwo ungapimika. Mwachiyelezgero, msinkhu wakupimika wa chipangizo chinyake cha mbale ya enzyme ni 0.000 ~ 2.900, apo msinkhu wake wa mzere ni 0.000 ~ 2.000 pera, uwo ukwenera kuŵikikapo mtima para ukupanga mzere wakukhora mu ELISA ya unandi.

Chida cha enzyme label chikwenera yayi kuŵikika pasi pa ungweru wa dazi panji ungweru wankhongono. Kutentha kwa chipinda kukwenera kuŵa 15 ~ 30℃pa nyengo ya ntchito. Chipangizo ichi chikwenera kutenthemeska dankha kwa maminiti 15 panji 30 pambere chindaseŵezeskeke, mwakuti ivyo vikuŵazgika viŵe vyakukhora.

Pakupima mtengo wa A, nsonga yakuyamwa yakukhwaskana na chinthu yikwenera kusankhika. Mwachiyelezgero, OPD yikugwiriskira nchito utali wa mafunde wa 492nm. Nyengo yakwamba yili pa utali wa mafunde wakukwana (W1) ndipo nyengo yachiŵiri yili pa utali wa mafunde agho ghakuwoneka yayi (W2). Malo gha mbale ya ELISA ghakusunthika yayi pakati pa miyeso yiŵiri. Mwachiyelezgero, OPD yikugwiriskira ncito 492nm nga ni W1 na 630nm nga ni W2, ndipo mtengo wa A wakupimika waumaliro ni mphambano pakati pa viŵiri ivi (W1-W2). Kuŵerenga kwa ma wavelength ghaŵiri kungapangiska kuti ungweru uleke kutimbanizgika chifukwa cha kukhwaŵa panji kuŵika vimanyikwiro vya minwe pa chiŵiya.